Навигация по таблицам
- Таблица 1: Состав LB-среды (различные формулировки)
- Таблица 2: Среды для клеток млекопитающих (DMEM, RPMI-1640)
- Таблица 3: Состав YPD/YEPD среды для дрожжей
- Таблица 4: Сравнительная таблица основных компонентов
- Таблица 5: Буферные системы и pH питательных сред
- Таблица 6: Селективные и дифференциальные среды
Таблица 1: Состав LB-среды (различные формулировки)
| Компонент | LB Miller (г/л) | LB Lennox (г/л) | LB Luria (г/л) | Функция |
|---|---|---|---|---|
| Триптон | 10 | 10 | 10 | Источник аминокислот и пептидов |
| Дрожжевой экстракт | 5 | 5 | 5 | Витамины, микроэлементы |
| NaCl | 10 | 5 | 10 | Осмотический баланс |
| Глюкоза (опционально) | 1 | 1 | 1 | Углеродный источник |
| Агар (для твердой среды) | 15 | 15 | 15 | Желирующий агент |
| pH | 7.0-7.4 | 7.0-7.4 | 7.0-7.4 | Оптимальный рост |
Таблица 2: Среды для клеток млекопитающих (DMEM, RPMI-1640)
| Компонент | DMEM (мг/л) | RPMI-1640 (мг/л) | Назначение |
|---|---|---|---|
| Глюкоза | 1000-4500 | 2000 | Основной энергетический субстрат |
| L-глутамин | 584 | 300 | Аминокислота, источник азота |
| Пируват натрия | 110 | 0 | Энергетический субстрат |
| NaHCO₃ | 3700 | 2000 | Буферная система |
| Фенол красный | 15 | 5 | pH индикатор |
| HEPES (опционально) | 5958 | 5958 | Дополнительный буфер |
| Аминокислоты (всего) | 13 незаменимых | 20 всего | Синтез белков |
| Витамины | 12 типов | 11 типов | Кофакторы ферментов |
Таблица 3: Состав YPD/YEPD среды для дрожжей
| Компонент | Концентрация (г/л) | Концентрация (%) | Функция |
|---|---|---|---|
| Дрожжевой экстракт | 10 | 1 | Витамины группы B, аминокислоты |
| Пептон | 20 | 2 | Источник азота, витамины, минералы |
| Декстроза (глюкоза) | 20 | 2 | Углеродный источник энергии |
| Агар (для твердой среды) | 20 | 2 | Желирующий агент |
| Вода дистиллированная | До 1000 мл | - | Растворитель |
| pH (финальный) | 6.5 ± 0.2 | - | Оптимальные условия роста |
Таблица 4: Сравнительная таблица основных компонентов
| Характеристика | Бактериальные среды | Дрожжевые среды | Среды для млекопитающих |
|---|---|---|---|
| Основной углеродный источник | Глюкоза (1-5 г/л) | Глюкоза (20 г/л) | Глюкоза (1-4.5 г/л) |
| Основной азотный источник | Триптон, дрожжевой экстракт | Пептон, дрожжевой экстракт | Аминокислоты, L-глутамин |
| Буферная система | Фосфатная, Трис | Естественная (pH 6.5) | Бикарбонатная, HEPES |
| Осмолярность | 280-320 мОсм/кг | 300-400 мОсм/кг | 290-320 мОсм/кг |
| Требования к CO₂ | Не требуется | Не требуется | 5-10% CO₂ |
| Температура культивирования | 37°C | 30°C | 37°C |
| Время удвоения | 20-30 минут | 90-120 минут | 12-24 часа |
Таблица 5: Буферные системы и pH питательных сред
| Буферная система | Концентрация | Диапазон pH | Применение | Особенности |
|---|---|---|---|---|
| Фосфатная (KH₂PO₄/K₂HPO₄) | 10-50 мМ | 6.0-8.0 | Бактериальные среды | Экономичная, стабильная |
| Бикарбонатная (NaHCO₃) | 24-44 мМ | 7.0-7.6 | Клетки млекопитающих | Требует CO₂ атмосферу |
| HEPES | 10-25 мМ | 6.8-8.2 | Универсальная | Не зависит от CO₂ |
| Трис-HCl | 10-100 мМ | 7.0-9.0 | Молекулярная биология | Температурозависимая |
| MOPS | 10-100 мМ | 6.5-7.9 | Клеточные культуры | Низкая токсичность |
| Цитратная | 50 мМ | 3.0-6.2 | Кислотофильные бактерии | Может метаболизироваться |
Таблица 6: Селективные и дифференциальные среды
| Среда | Тип | Селективный агент | Целевые организмы | Применение |
|---|---|---|---|---|
| MacConkey Agar | Селективно-дифференциальная | Желчные соли, кристалл-виолет | Грам-отрицательные бактерии | Выделение энтеробактерий |
| Blood Agar | Обогащенная-дифференциальная | 5% овечья кровь | Streptococcus, Staphylococcus | Определение гемолиза |
| Mannitol Salt Agar | Селективно-дифференциальная | 7.5% NaCl | Staphylococcus spp. | Выделение стафилококков |
| Sabouraud Dextrose Agar | Селективная | Низкий pH (5.6) | Грибы и дрожжи | Микологические исследования |
| Chocolate Agar | Обогащенная | Нагретая кровь | Haemophilus, Neisseria | Капризные патогены |
| EMB Agar | Селективно-дифференциальная | Эозин, метиленовый синий | E. coli, Enterobacter | Дифференциация колиформ |
Оглавление статьи
- 1. Введение в питательные среды для микробиологии
- 2. Питательные среды для бактерий
- 3. Среды для культивирования дрожжей
- 4. Среды для клеток млекопитающих
- 5. Селективные и дифференциальные среды
- 6. Расчеты и приготовление питательных сред
- 7. Контроль качества и стерилизация
- 8. Современные тенденции и инновации
- 9. Часто задаваемые вопросы (FAQ)
Введение в питательные среды для микробиологии
Питательные среды представляют собой фундаментальную основу микробиологических исследований, биотехнологии и клеточных культур. Правильный выбор и приготовление питательных сред критически важны для успешного культивирования микроорганизмов, дрожжей и клеток млекопитающих в лабораторных условиях.
Согласно действующему ГОСТ ISO 11133-2016 и современным исследованиям, опубликованным в 2024-2025 годах, качество питательных сред напрямую влияет на воспроизводимость результатов, скорость роста культур и продуктивность биотехнологических процессов. Неправильно подобранная среда может привести к получению ложных результатов и загрязнению культуры.
Питательные среды классифицируются по нескольким критериям: по составу (определенные и неопределенные), по консистенции (жидкие, полужидкие, твердые), по назначению (основные, обогащенные, селективные, дифференциальные) и по происхождению компонентов (натуральные, синтетические, полусинтетические).
Питательные среды для бактерий
Бактериальные питательные среды должны обеспечивать все необходимые элементы для роста и размножения бактерий: источники углерода, азота, фосфора, серы, а также микроэлементы и витамины. Наиболее широко используемой средой для культивирования бактерий является LB-среда (Lysogeny Broth), разработанная Джузеппе Бертани в 1951 году.
LB-среда и ее разновидности
Существует три основные формулировки LB-среды, различающиеся концентрацией хлорида натрия. LB Miller содержит 10 г/л NaCl и является наиболее распространенной формулировкой. LB Lennox содержит 5 г/л NaCl и подходит для работы с солечувствительными антибиотиками. LB Luria представляет оригинальную формулировку с 10 г/л NaCl и 1 г/л глюкозы.
Расчет приготовления 1 литра LB Miller:
Компоненты:
• Триптон: 10 г
• Дрожжевой экстракт: 5 г
• NaCl: 10 г
• Дистиллированная вода: до 1000 мл
Общая осмолярность: ≈ 315 мОсм/кг
Триптон в составе LB-среды служит источником аминокислот и пептидов, необходимых для синтеза белков бактериальными клетками. Дрожжевой экстракт обеспечивает витамины группы B, микроэлементы и дополнительные органические соединения. Хлорид натрия поддерживает осмотический баланс и обеспечивает транспорт ионов.
Пример применения LB-среды:
Для культивирования E. coli с плазмидой, содержащей ген устойчивости к ампициллину, в LB-среду добавляют ампициллин в концентрации 100 мкг/мл. Это обеспечивает селективное давление и позволяет расти только трансформированным клеткам.
Специализированные бактериальные среды
Для специфических исследований используются модифицированные среды. Минимальная среда M9 содержит только необходимые неорганические соли и один источник углерода, что позволяет изучать метаболические пути. Среда SOB (Super Optimal Broth) обогащена ионами магния и калия для повышения эффективности трансформации.
Среды для культивирования дрожжей
Дрожжи, особенно Saccharomyces cerevisiae, широко используются в молекулярной биологии, биотехнологии и фундаментальных исследованиях. Для их культивирования применяются как богатые, так и минимальные среды, в зависимости от целей исследования.
YPD/YEPD среда
YPD (Yeast extract Peptone Dextrose) или YEPD (Yeast Extract Peptone Dextrose) является стандартной богатой средой для культивирования дрожжей. Среда обеспечивает быстрый рост большинства штаммов Saccharomyces cerevisiae и других дрожжевых организмов.
Расчет для приготовления 500 мл YPD:
Компоненты:
• Дрожжевой экстракт: 5 г (1%)
• Пептон: 10 г (2%)
• Декстроза: 10 г (2%)
• Дистиллированная вода: до 500 мл
Финальный pH: 6.5 ± 0.2
Время автоклавирования: 15 минут при 121°C
Дрожжевой экстракт в YPD-среде содержит все необходимые аминокислоты, витамины группы B и микроэлементы. Пептон служит дополнительным источником азота и витаминов. Декстроза является предпочтительным источником углерода для большинства дрожжей и обеспечивает быстрый рост культуры.
Синтетические среды для дрожжей
Для генетических исследований часто используются синтетические среды, такие как SC (Synthetic Complete) или SD (Synthetic Dextrose). Эти среды содержат определенные количества всех компонентов и позволяют проводить ауксотрофную селекцию.
Применение селективной SC-среды:
SC-His среда (без гистидина) используется для селекции дрожжевых клеток, трансформированных плазмидой с геном HIS3. Только клетки, содержащие плазмиду, могут расти на такой среде, так как они способны синтезировать гистидин.
Среды для клеток млекопитающих
Культивирование клеток млекопитающих требует значительно более сложных питательных сред по сравнению с бактериальными и дрожжевыми культурами. Клетки млекопитающих нуждаются в точно сбалансированном составе аминокислот, витаминов, минералов и факторов роста.
DMEM - Dulbecco's Modified Eagle's Medium
DMEM является одной из наиболее широко используемых сред для культивирования прикрепленных клеток млекопитающих. Среда была модифицирована Ренато Дульбекко в 1959 году и содержит в четыре раза больше аминокислот и витаминов по сравнению с оригинальной средой Eagle.
Современные формулировки DMEM доступны с различными концентрациями глюкозы: низкоглюкозная (1 г/л) и высокоглюкозная (4.5 г/л). Высокоглюкозная версия подходит для быстро пролиферирующих клеток, но может приводить к накоплению лактата и закислению среды.
Основные компоненты DMEM высокоглюкозной:
Макрокомпоненты:
• Глюкоза: 4500 мг/л (25 мМ)
• L-глутамин: 584 мг/л (4 мМ)
• Пируват натрия: 110 мг/л (1 мМ)
• NaHCO₃: 3700 мг/л (44 мМ)
Осмолярность: 320 ± 10 мОсм/кг
RPMI-1640 среда
RPMI-1640 была разработана в институте Розуэлл Парк для культивирования лимфоцитов человека и широко используется для суспензионных культур. Среда содержит уникальный восстанавливающий агент глутатион и высокие концентрации витаминов.
Ключевые отличия RPMI-1640 от DMEM включают более высокое содержание фосфатов (в три раза выше физиологической нормы), низкие концентрации кальция и магния, а также присутствие биотина и витамина B12, которых нет в DMEM.
Дополнения к средам для млекопитающих
Практически все среды для клеток млекопитающих требуют дополнения фетальной бычьей сывороткой (FBS) в концентрации 5-20%. FBS обеспечивает факторы роста, гормоны, белки-переносчики и протеазные ингибиторы. Альтернативно используются бессывороточные среды с определенными добавками.
Селективные и дифференциальные среды
Селективные среды содержат агенты, которые подавляют рост нежелательных микроорганизмов, позволяя расти только целевым видам. Дифференциальные среды содержат индикаторы, которые позволяют различать микроорганизмы по их метаболическим свойствам.
MacConkey агар
MacConkey агар является классическим примером селективно-дифференциальной среды. Желчные соли и кристалл-виолет подавляют рост грам-положительных бактерий, а лактоза с индикатором нейтральный красный позволяет дифференцировать лактозоположительные и лактозоотрицательные энтеробактерии.
Кровяной агар
Кровяной агар содержит 5% овечьей крови и используется для выявления гемолитической активности бактерий. α-гемолиз проявляется зеленоватым окрашиванием вокруг колоний, β-гемолиз - полным просветлением, γ-гемолиз означает отсутствие гемолиза.
Практическое применение селективных сред:
При выделении Salmonella из клинических образцов используется среда XLD (Xylose Lysine Deoxycholate), которая селективно подавляет грам-положительные бактерии и большинство энтеробактерий, позволяя расти сальмонеллам, которые образуют характерные красные колонии с черным центром.
Расчеты и приготовление питательных сред
Правильные расчеты критически важны для воспроизводимости результатов и эффективности культивирования. При приготовлении сред необходимо учитывать молярность, осмолярность, pH и стабильность компонентов.
Расчет молярности и процентных концентраций
Молярность рассчитывается по формуле: M = n/V, где n - количество молей растворенного вещества, V - объем раствора в литрах. Для приготовления процентных растворов используется формула: C% = (масса растворенного вещества / общая масса раствора) × 100%.
Пример расчета: приготовление 2 л среды LB с ампициллином
Шаг 1: Расчет компонентов LB для 2 л
• Триптон: 10 г/л × 2 л = 20 г
• Дрожжевой экстракт: 5 г/л × 2 л = 10 г
• NaCl: 10 г/л × 2 л = 20 г
Шаг 2: Расчет ампициллина (100 мкг/мл)
• 100 мкг/мл × 2000 мл = 200,000 мкг = 200 мг
• Из стока 100 мг/мл: 200 мг ÷ 100 мг/мл = 2 мл
Корректировка pH
pH среды критически важен для роста культуры. Для бактериальных сред оптимальный pH составляет 7.0-7.4, для дрожжей - 6.0-6.5, для клеток млекопитающих - 7.2-7.4. Корректировка проводится с помощью растворов NaOH или HCl с постоянным контролем pH-метром.
Расчет осмолярности
Осмолярность среды должна соответствовать физиологическим требованиям культивируемых организмов. Для большинства бактерий оптимальная осмолярность составляет 280-320 мОсм/кг, для клеток млекопитающих - 290-320 мОсм/кг.
Контроль качества и стерилизация
Качество питательных сред напрямую влияет на результаты экспериментов и успешность культивирования. Согласно действующему ГОСТ ISO 11133-2016 "Микробиология пищевых продуктов, кормов для животных и воды", контроль качества включает проверку pH, осмолярности, стерильности и ростовых характеристик среды.
Методы стерилизации
Автоклавирование при 121°C в течение 15-20 минут является стандартным методом стерилизации большинства питательных сред. Термолабильные компоненты (антибиотики, витамины, сыворотка) стерилизуются фильтрованием через фильтры 0.22 мкм и добавляются асептически после остывания среды.
Контроль стерильности
Каждая партия среды должна проходить контроль стерильности. Образцы среды инкубируются при 37°C в течение 48-72 часов без инокуляции. Отсутствие роста свидетельствует о стерильности. Дополнительно проводится тест на ростовые свойства с использованием стандартных тест-культур.
Хранение питательных сред
Приготовленные среды хранятся при температуре 2-8°C в защищенном от света месте. Срок хранения жидких сред не превышает 4 недель, агаровых пластин - 8 недель. Среды с добавками (антибиотики, сыворотка) имеют более короткий срок хранения.
Современные тенденции и инновации
Развитие биотехнологии и персонализированной медицины стимулирует создание новых типов питательных сред с улучшенными характеристиками и специфическими свойствами.
Физиологически релевантные среды
Современные исследования показывают необходимость разработки сред, более точно имитирующих физиологические условия. Среды типа Plasmax и HPLM (Human Plasma-like Medium) разработаны с концентрациями компонентов, соответствующими уровням в плазме крови человека.
Бессывороточные и химически определенные среды
Развитие бессывороточных сред решает проблемы воспроизводимости и этических вопросов, связанных с использованием фетальной бычьей сыворотки. Современные бессывороточные среды содержат рекомбинантные факторы роста, инсулин, трансферрин и другие определенные компоненты.
Инновационные среды 2024-2025:
Advanced DMEM: Содержит на 50-90% меньше FBS при сохранении ростовых характеристик благодаря добавлению специфических факторов роста и гормонов.
Chemically Defined Grape Juice Medium (CDGJM): Синтетическая среда для винных дрожжей, имитирующая состав виноградного сока.
3D-культуральные среды
Развитие трехмерного культивирования клеток требует специализированных сред, поддерживающих рост органоидов и сфероидов. Такие среды содержат дополнительные матриксные белки, факторы дифференцировки и имеют оптимизированные концентрации кислорода и CO₂.
Часто задаваемые вопросы (FAQ)
Основное различие между этими формулировками LB-среды заключается в концентрации хлорида натрия (NaCl). LB Miller содержит 10 г/л NaCl и является наиболее стандартной формулировкой. LB Lennox содержит 5 г/л NaCl и рекомендуется для работы с солечувствительными антибиотиками, такими как зеоцин. LB Luria представляет оригинальную формулировку Бертани с 10 г/л NaCl и дополнительно содержит 1 г/л глюкозы. Все остальные компоненты (триптон 10 г/л, дрожжевой экстракт 5 г/л) остаются неизменными во всех формулировках.
DMEM является универсальной средой для большинства прикрепленных клеток млекопитающих, включая HeLa, 293, Cos-7, первичные фибробласты и нейроны. Однако для некоторых специализированных клеток могут потребоваться другие среды. Например, RPMI-1640 лучше подходит для лимфоцитов и суспензионных культур, а среда Ham's F-12 оптимальна для клеток CHO. Для достижения лучших результатов рекомендуется использовать среду, специально рекомендованную для конкретной клеточной линии.
YPD является полной (богатой) средой, содержащей все необходимые аминокислоты, витамины и питательные вещества в дрожжевом экстракте и пептоне. Ауксотрофные штаммы дрожжей, которые не могут синтезировать определенные аминокислоты (например, гистидин, лейцин), смогут расти на YPD, поскольку все необходимые компоненты уже присутствуют в среде. Для ауксотрофной селекции необходимо использовать синтетические среды типа SC (Synthetic Complete) или SD (Synthetic Dextrose), из которых исключены специфические аминокислоты или витамины.
Антибиотики должны добавляться в среду после автоклавирования и охлаждения до температуры 50-60°C, поскольку большинство антибиотиков термолабильны. Готовятся концентрированные стоковые растворы антибиотиков (обычно в 1000-кратной концентрации), которые стерилизуются фильтрованием и хранятся при -20°C. Наиболее часто используемые концентрации: ампициллин - 100 мкг/мл, канамицин - 50 мкг/мл, хлорамфеникол - 34 мкг/мл. Важно учитывать совместимость антибиотика с составом среды - например, карбенициллин более стабилен, чем ампициллин в присутствии солей.
Выбор буферной системы зависит от условий культивирования. Бикарбонатная система (NaHCO₃) является стандартной для клеток млекопитающих, но требует контролируемой атмосферы CO₂ (5-10%). HEPES буфер не зависит от CO₂ и подходит для работы в обычной атмосфере, но может быть токсичен при высоких концентрациях и под воздействием света. Для бактериальных культур часто используется фосфатная буферная система. При pH ниже 7.0 рекомендуется цитратный буфер, а для молекулярно-биологических применений - Трис-HCl.
Контроль качества питательной среды включает несколько этапов: проверка pH (должен соответствовать спецификации ±0.1), контроль стерильности (инкубация образцов при 37°C в течение 48-72 часов без роста), проверка осмолярности (290-320 мОсм/кг для большинства сред), тест на ростовые свойства с использованием стандартных тест-культур. Визуально среда должна быть прозрачной, без осадков и помутнений. Агаровые пластины должны иметь гладкую поверхность без трещин и пузырьков воздуха.
Срок хранения зависит от типа среды и условий хранения. Жидкие автоклавированные среды хранятся при 2-8°C до 4 недель. Агаровые пластины можно хранить до 8 недель в холодильнике в герметичных пакетах для предотвращения высыхания. Среды с добавками (антибиотики, витамины, сыворотка) имеют более короткий срок - обычно 1-2 недели. Среды с L-глутамином следует использовать в течение 2-3 недель, поскольку глутамин спонтанно деградирует с образованием токсичного аммиака. Всегда проверяйте среды перед использованием на отсутствие контаминации и изменения цвета.
Бессывороточные среды имеют ряд преимуществ: улучшенная воспроизводимость результатов благодаря определенному составу, снижение риска контаминации вирусами и микоплазмой, отсутствие этических проблем, связанных с получением фетальной бычьей сыворотки, упрощение процедур очистки продуктов (белков, антител), снижение стоимости при масштабировании производства. Современные бессывороточные среды содержат рекомбинантные факторы роста, инсулин, трансферрин, селен и другие определенные компоненты, которые обеспечивают эффективный рост клеток без использования сыворотки.
Заключение
Правильный выбор и приготовление питательных сред является критически важным фактором успешности микробиологических исследований и биотехнологических процессов. Данная статья носит ознакомительный характер и предназначена для образовательных целей.
Источники информации:
1. Bertani, G. (1951). Studies on lysogenesis. Journal of Bacteriology, 62(3), 293-300.
2. Dulbecco, R., & Vogt, M. (1954). Plaque formation and isolation of pure lines with poliomyelitis viruses. Journal of Experimental Medicine, 99(2), 167-182.
3. Moore, G. E., et al. (1967). Culture of normal human leukocytes. JAMA, 199(8), 519-524.
4. Sherman, F. (2002). Getting started with yeast. Methods in Enzymology, 350, 3-41.
5. Актуальные исследования в области питательных сред (2024-2025). BMC Microbiology, Cell Culture Research.
Отказ от ответственности:
Автор не несет ответственности за результаты применения информации, изложенной в данной статье. Перед использованием любых методик и рецептур питательных сред рекомендуется консультация со специалистами и изучение актуальных протоколов. Все экспериментальные работы должны проводиться с соблюдением правил биологической безопасности.
